海南超净工作台在纤维细胞生物学实验的使用

近年来，随着组织工程及**医学的迅猛进展脂肪干细胞鉴于其取卡材便利，来源丰富，低免疫性及多分化潜能等诸多优点，已成为人们研究的热门。但以往的研究大多集中在ADSCs多分化潜能在组织工程和**医学中的应用，很少关照ADSCs分泌功能在组织损伤修复中的作用。本实验通过使用超净工作台并观测研究了ADSCs分泌功能对成纤维细胞的生物学影响，探讨ADSCs分泌功能促创面愈合的机制。

材料和方法

1 主要仪器与试剂：DMEM培养液、胰酶、I型胶原酶、二甲基亚砜、MTT、小牛血清，胎牛血清，annexinV凋亡检测试剂盒，Mondel680型酶标仪，垂直流超净工作台，CO2细胞培养箱，颠倒显微镜，流式细胞仪。

2 ADSCs分离与培养：取腹部外科手术患者皮下脂肪组织约59，无菌条件下用剪刀剔除血管及其它组织碎片，用含双抗的PBS液反复浸泡冲洗3次，每次约5min，用眼科剪将脂肪组织剪成约lmm3的碎块，置于0.1%的I型胶原酶中于37℃水浴振荡消化1h;加入等体积l0%胎牛血清精细消化后，用200目的细胞筛网过滤，600g离心lOmin，弃去上层脂肪及上清液，沉淀用含l0%胎牛血清培养液重悬接种于培养瓶，置于37℃、5%的C02培养箱中陈规培养。2天后换液，细胞长满80%时传代培养。

3 3ADSCs培养上清液的制备：选择生长良好第3代.ADSCs细胞接种于75cm2的培养瓶，生长至80%融合时，换成尢血清培养液DMEM15ml，培养3天后，搜集上清液。上清液经O.22μm的滤膜过滤.分装，一80。C冻存备用。

4 人皮肤成纤维细胞的培养：用组织块法培养原代细胞，置于10%小牛血清培养液中，置于37℃、5%C02培养箱中陈规培养。

5 成纤维细胞增殖的测定：采纳MTT法测定。传代时取第3代成纤维细胞以3×10/孔接种于12孔板，陈规培养24h后弃上清，设实验组及对比组，实验组均用ADSC-CM及2%小牛血清配制，对比组仅用2%小牛血清培养液，每组设3个复孔。各组加对应的培养液lml，连续培养3天后，每孔分别加入5g/L的MTT100μl，37℃、5%C02孵育4h后，精细培养：吸弃上清液，每孔加入750μl。二甲基亚枫，连续孵育lOmin后稍微振荡使紫蓝色沉淀融解，然后以150μl/孔移动至96孔板，每孔反复5次。用酶标仪测定490nm波长下的吸光度值。